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PCR-SSCP原理和操作步骤

时间:2024-10-15 16:43:08

1、 PCR反应(同前)PCR产物经琼脂糖电泳确认。

2、 PCR反应结束后,取5μl扩增产物加10μl甲酰胺上样缓冲液混匀,98℃ 变性10分钟,迅速冰浴

3、 非筐毙险裆变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。(1)制备50 ml 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶,加 TEMED 25 μl、10%夸臾蓠鬏过硫酸铵250 μl,混匀后灌胶,插入加样梳子。待胶完全聚合后,拔出加样梳子,安装电泳装置,加入1´TBE电泳缓冲液,缓冲液应高于加样孔上缘,用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。(2)取已变性的5 μl PCR扩增产物加到点样孔中,以20 V/cm 电泳 4~5小时。(3)拆下电泳装置,取出聚丙烯酰胺凝胶,放到一个塑料盘内,用蒸馏水冲洗1~2遍。(4)倒入固定液,固定 8~10分钟。(5)用蒸馏水冲洗1~2遍;倒入银染液,银染10~12分钟。(6)用蒸馏水冲洗若干遍;倒入显色液,显色至出现清晰的银染带。(7)用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶,观察PCR-SSCP结果。

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